泥鳅为多次性产卵鱼类。在自然条件下，4月上旬开始繁殖，5～6月是产卵盛期，一直延续到9月还可产卵。繁殖的水温为18～30℃，适水温为22～28℃。
雌鳅性成熟较雄鳅迟，体长5厘米时，雌鳅体内有一对卵巢，体长8厘米时，2个卵巢愈合在一起，成为1个卵巢，并由前端向后端延伸，这时整个卵巢发育开始成熟。
雌鳅怀卵量因个体大小不同而有很大差异。小性成熟个体体长8厘米，怀卵量约2000粒左右，10厘米的怀卵量为7000～10000粒，体长12厘米的怀卵量12000～14000粒，体长15厘米的怀卵量为15000～18000粒，体长20厘米怀卵量为24000粒左右。怀卵量多的可以超过6.5万粒。卵圆形，卵径0.8～1.0毫米左右，吸水后膨胀到1.3～1.5毫米，卵黄色，为半黏性，黏附力不强。由于卵在卵巢内成熟度不一致，每次排卵量约为怀卵数的50%～60%。
雄鳅小性成熟个体体长在6厘米以上，性成熟较雌鳅早，雄鳅精巢一对，位于腹腔两侧，呈带状且不对称，右侧的精巢比左侧的长而狭窄，重量也轻一些，当雄鳅体长为9～11厘米时，精巢内的精子约有亿个。泥鳅产卵喜在雨后晴天的早晨，产卵前，雌鳅在前面游动．数尾雄鳅在其后紧追不舍，发情时，雌雄鳅多活动在水表面和鱼巢周围，当发情达到高潮时，雌雄鳅的头部和躯体互相摩擦并相继游出水面。雄鳅追逐纠缠雌鳅，并卷曲于雌鳅腹部，以刺激雌鳅产卵，同时雄鳅也排出精子，进行体外受精，这种动作因个体大小不同而次数也不相等，个体大的可在10次以上，受精卵先黏附在水草或其他附着物上，随着水的波动，极易从附着物上脱落沉到水底。